量子點(diǎn)與高靈敏、高通量流式細(xì)胞術(shù)，了解一下？
原創(chuàng) 2018-05-04 昆道生物
流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）是集光學(xué)、應(yīng)用流體學(xué)、電子學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等多門學(xué)科與技術(shù)于一體的新型高科技儀器。 
流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、分析系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng) 5 個(gè)部分組成。
其核心技術(shù)——流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀，使單個(gè)細(xì)胞或其他微小生物粒子處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)，且逐個(gè)通過光束，從而對(duì)單個(gè)細(xì)胞或微粒進(jìn)行多參數(shù)（數(shù)量、大小、核酸含量、細(xì)胞活性、特定菌群或物種等）定量分析和分選的檢測(cè)技術(shù)。FCM 通過激光光源激發(fā)細(xì)胞上所標(biāo)記的熒光物質(zhì)的強(qiáng)度和顏色以及散射光的強(qiáng)度可以得到細(xì)胞內(nèi)部各種各樣的生物信息；也可以利用高分子熒光微球在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行免疫或聚合酶鏈反應(yīng)等多種生物檢測(cè)技術(shù)。因此FCM在細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)、微生物、食品安全檢測(cè)等方面得到了廣泛應(yīng)用。
Web of Science中輸入關(guān)鍵詞quantum dot*和flow cytomet*，文章檢索篇數(shù)
傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)采用熒光染料（如羅丹明、FITC）作為標(biāo)記分子，利用生物分子之間可特異性識(shí)別結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。但傳統(tǒng)熒光染料熒光強(qiáng)度較低，難以滿足高靈敏檢測(cè)的需要；抗光漂白能力較差，產(chǎn)生的熒光很不穩(wěn)定，容易淬滅；激發(fā)波長(zhǎng)窄、發(fā)射波長(zhǎng)寬，需要多波長(zhǎng)激發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記。以上不足限制了熒光染料在高靈敏度、高通量流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用。
相比于傳統(tǒng)熒光染料，量子點(diǎn)具有諸多優(yōu)點(diǎn)得以應(yīng)用于生物標(biāo)記：寬波長(zhǎng)激發(fā)、窄波長(zhǎng)發(fā)射的光譜學(xué)特性，可應(yīng)用于同時(shí)激發(fā)和多色標(biāo)記進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多組分分析；熒光強(qiáng)度高，光穩(wěn)定性好，抗光漂白能力強(qiáng)，量子點(diǎn)在曝光數(shù)小時(shí)后依然保持穩(wěn)定的熒光產(chǎn)率而不被漂白，適用于實(shí)時(shí)和長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)生物學(xué)過程。
量子點(diǎn)在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用原理圖
量子點(diǎn)編碼微球技術(shù)
量子點(diǎn)編碼微球的制備大多采用量子點(diǎn)與高分子聚合物（聚苯乙烯微球、聚乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物微球等）結(jié)合，其制備方法主要包括溶脹法、層層自組裝、溶膠-凝膠封裝、膜乳化-溶劑揮發(fā)法等。一些研究分析中創(chuàng)新性地將磁性納米粒子引入量子點(diǎn)編碼微球，使其兼具編碼、富集、分離的功能，實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)的自動(dòng)化與及時(shí)檢測(cè)。制備的量子點(diǎn)編碼微球表面功能化修飾羧基、氨基等官能團(tuán)，通過EDC/NHS、生物素-親和素系統(tǒng)、點(diǎn)擊化學(xué)等方法活化進(jìn)而與生物分子偶聯(lián)結(jié)合，發(fā)揮其生物檢測(cè)功能。
膜乳化-溶劑揮發(fā)法合成量子點(diǎn)免疫磁珠
量子點(diǎn)或量子點(diǎn)編碼微球在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用
細(xì)胞生物學(xué)
定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系，進(jìn)行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體。Park等報(bào)道了一種采用聚乙烯亞胺填埋量子點(diǎn)合成水化半徑為100 nm左右的微球，通過流式細(xì)胞平臺(tái)觀察到，胞內(nèi)量子點(diǎn)傳遞速度顯著加快。該技術(shù)可為基因傳遞、細(xì)胞定位、細(xì)胞內(nèi)敏化單態(tài)氧檢測(cè)等提供方法學(xué)。與傳統(tǒng)細(xì)胞標(biāo)記方法（脂質(zhì)體包裹、CTAB包裹量子點(diǎn)）相比，該方法的熒光強(qiáng)度高10倍，細(xì)胞毒性更小。
聚乙烯亞胺填埋量子點(diǎn)的應(yīng)用：細(xì)胞標(biāo)記，基因沉默RNA運(yùn)載，細(xì)胞特異性識(shí)別
腫瘤學(xué)
腫瘤標(biāo)記物是腫瘤細(xì)胞在癌變過程中癌基因表達(dá)生成的抗原和其它生物活性物質(zhì)。量子點(diǎn)標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)和傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)手段不同，主要是利用腫瘤標(biāo)志物和偶聯(lián)量子點(diǎn)的特異性抗體發(fā)生免疫夾心反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)物免疫量子點(diǎn)的熒光產(chǎn)率即可表征腫瘤標(biāo)志物的含量。也有研究采用量子點(diǎn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物如CD133，CD44和ALDH1進(jìn)行標(biāo)記，借助流式細(xì)胞儀分析黃曲霉毒素暴露對(duì)肝臟腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)突變作用及定量關(guān)系。
量子點(diǎn)編碼微球應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物AFP的檢測(cè)
免疫學(xué)
量子點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系；進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化；分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等。
量子點(diǎn)在CTLs細(xì)胞群免疫表現(xiàn)分析中的應(yīng)用-結(jié)合示意圖
微生物檢測(cè)
流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為微生物學(xué)研究中一種必不可少的手段，在微生物檢測(cè)中扮演著越來(lái)越重要的角色。借助量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光特性，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)微生物尤其是細(xì)菌這類形體極其微小的粒子的分析優(yōu)勢(shì)更為明顯，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的逐個(gè)檢測(cè)、靈敏、快速、多參數(shù)分析等精確測(cè)量。Yang等使用氯仿-SDS或溶菌酶-EDTA處理大腸桿菌細(xì)胞壁外層，增加其外壁透性，克服了革蘭氏陰性細(xì)菌直接標(biāo)記量子點(diǎn)的技術(shù)難題，成功實(shí)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記量子點(diǎn)。借助流式細(xì)胞儀對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記大腸桿菌的實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。這為細(xì)菌的多參數(shù)分析提供了一種快速、靈敏的方法。
大腸桿菌量子點(diǎn)標(biāo)記
小分子污染物分析
隨著人們對(duì)食品安全要求的提高 , 相對(duì)于其他檢測(cè)手段 , 流式細(xì)胞術(shù)已成為一種被認(rèn)可的重要分析技術(shù)。Zhang等采用溶脹懸浮聚合法以毒死蜱為載體，甲基丙烯酸為模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，量子點(diǎn)為熒光標(biāo)記合成基于量子點(diǎn)的分子印跡聚合物。借助流式細(xì)胞儀，該分子印跡聚合物可在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)自來(lái)水中毒死蜱殘留包括前處理的定量檢測(cè)。
不同毒死蜱濃度水平量子點(diǎn)標(biāo)記分子印跡聚合物散點(diǎn)圖
（(a) 0, (b) 0.02, (c) 0.04, (d) 0.06, (e) 0.08, (f) 0.1, (g) 0.15, (h) 0.2 mg/L.）
量子點(diǎn)在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用已延伸生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域中。隨著人們對(duì)分析技術(shù)的安全性重視度日益提高，無(wú)毒量子點(diǎn)的呼聲日漸。可喜的是，發(fā)光強(qiáng)度高、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、尺寸可調(diào)的無(wú)毒量子點(diǎn)如InP/ZnS、CuInS2 /ZnS已成功面世。并且，科學(xué)家們已將無(wú)毒量子點(diǎn)與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來(lái)，在生物分析如系統(tǒng)性紅斑狼瘡FcεRI的定量檢測(cè)中得到了應(yīng)用。
一句話可概括為，凡能被熒光分子標(biāo)記的細(xì)胞或微粒均能用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)特性必然促使它在流式細(xì)胞術(shù)領(lǐng)域成就一番更輝煌的作為。
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