為什么開展熒光Western Blotting？
概述
熒光western blotting（WB）檢測系統(tǒng)越來越受歡迎，因為與化學發(fā)光或顯色檢測系統(tǒng)相比，它在化學發(fā)光檢測方面節(jié)省了更多的時間，減少了化學廢物。過去，熒光Western Blot由于檢測靈敏度或檢測儀器過于昂貴而令人望而卻步。隨著新型熒光探針的開發(fā)，成像技術的進步，以及兩者成本的降低，熒光WB正在迅速取代許多實驗室的顯色和化學發(fā)光檢測方法。雖然熒光檢測限還沒有化學發(fā)光檢測那么低，但熒光檢測具有獨特的優(yōu)點，可以在同一印跡上同時檢測多個目標，而不需要剝離和重新孵育。
圖1 化學發(fā)光western blot檢測原理示意圖
圖2 熒光western blot檢測原理示意圖
在熒光western blot檢測系統(tǒng)中，信號以光的形式捕獲。熒光基團發(fā)出的瞬態(tài)光是由被激發(fā)的分子返回其正常狀態(tài)時光子的激發(fā)和隨后的釋放而產(chǎn)生的。相比之下，顯色和化學發(fā)光的western檢測系統(tǒng)產(chǎn)生的信號是酶-底物反應的產(chǎn)物。顯色酶-底物反應產(chǎn)生沉淀到膜上的有色產(chǎn)物，而化學發(fā)光檢測系統(tǒng)產(chǎn)生以光的形式釋放能量的酶反應。熒光應用可以比酶系統(tǒng)更定量。與酶反應類似，熒光試劑必須根據(jù)信噪比進行優(yōu)化。如果熒光標記的程度過低，信號就會變?nèi)?。然而，如果熒光標記的程度過高，信號也會因為檢測試劑的失活或信號的猝滅而變得微弱，這一現(xiàn)象被稱為熒光共振能量傳遞(Forster resonance energy transfer, FRET)。與熒光顯微鏡一樣，必須小心選擇經(jīng)過熒光驗證的支撐或基質(zhì)材料。典型的印跡膜，如硝基纖維素和聚偏二氟乙烯(PVDF)，已知具有熒光性質(zhì)，可導致顯著的背景時，使用熒光western印跡。然而，用于熒光檢測的試劑的激發(fā)波長和發(fā)射波長都是為了避免普通膜的自發(fā)熒光而選擇的。特殊的低熒光膜也可用于熒光western blots。
熒光WB檢測的優(yōu)點
熒光法使多重western blot分析成為可能，在同一blot上可以同時檢測和分化多個蛋白質(zhì)。例如，可以通過與熒光染料結(jié)合的二抗來檢測兩到三種不同的蛋白質(zhì)，這種熒光染料的熒光波長不同。二抗偶聯(lián)物與熒光染料Alexa Fluor被設計用于多種多樣的熒光蛋白和細胞分析免疫分析方法，包括多種western檢測。與基于酶的化學發(fā)光底物檢測相比，熒光western blot檢測除了能實現(xiàn)多路復用外，還有其他幾個優(yōu)點:
? 能夠在同一時間測定同一斑點上的多個目標
? 在查看多個目標時，不需要剝離和重新探測污點
? 無需擔心底物的孵育時間或膠片曝光
? 節(jié)省時間，保存樣品
? 提供可靠的定量數(shù)據(jù)
量子點熒光WB
量子點（quantum dot，簡稱QDs）作為一種新型熒光納米晶，具有一些獨特的熒光性能，如熒光發(fā)射波長可控、發(fā)射峰狹窄對稱、激發(fā)波長范圍廣、量子效率高、光穩(wěn)定性好等，量子點的上述熒光特性為制備高靈敏度的免疫熒光探針提供了很好的選擇。
量子點Western Blot技術具有靈敏、可定量、多元檢測等特點，早在2005年Ornberg等報道了量子點熒光技術在Western Blot分析中的應用；同年，Bakalova等報道了利用生物素-親和素信號放大的超靈敏Western Blot技術，與傳統(tǒng)的量子點標記物比較，生物素-親和素放大后的量子點Western Blot檢測靈敏度提高5倍，但上述生物素-親和素方法需要額外的孵育步驟，實驗步驟也更復雜。胥傳來等利用生物素-親和素的特異性結(jié)合反應，將量子點團聚制備得到親和素化的多聚量子點，然后與膜上的生物素化一抗結(jié)合，其對蛋白的檢測線性范圍為30-1500 pg；然而生物素-親和素制備的多聚量子點步驟較復雜且保質(zhì)期較短，且需要生物素化的一抗，因而在Western Blot的應用中受限制較多。
盡管目前關于量子點在Western Blot檢測中的應用有較多的報道，但量子點免疫熒光探針在對非常微量的蛋白進行檢測時，還存在信號低，噪音干擾大等問題。因此對目前的量子點免疫熒光探針制備方法進行改進，提高檢測的靈敏度、穩(wěn)定性和易操作性是目前分析檢測領域迫切的需求。且目前關于量子點在Western Blot檢測中的應用也較少與實驗室常用的化學發(fā)光顯色方法進行平行比較。
與現(xiàn)有的技術相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
? 檢測靈敏度更高、信號檢測時無需額外的信號放大步驟、量子點納米球熒光二抗保質(zhì)期更持久等特點。
? 無需發(fā)光底物、檢測信號更穩(wěn)定可長期保存、結(jié)果的一致性和可重復性等特點。
? 熒光信號更穩(wěn)定、無需避光操作、無需特殊的近紅外激光掃描儀檢測等特點。
圖3 化學發(fā)光（ECL）與量子點熒光（QBC）檢測Hela細胞中內(nèi)參蛋白GAPDH的結(jié)果比較。
（從左至右各泳道總蛋白上樣量，5,10,15,20,25,30μg）
圖4 化學發(fā)光（ECL）與量子點熒光（QBC）檢測Hela細胞中內(nèi)參蛋白Tubulin的結(jié)果比較。
（從左至右各泳道總蛋白上樣量，5,10,15,20,25,30μg）
熒光western blotting檢測儀器
熒光western blotting的結(jié)果需要特殊的儀器檢測，即一種熒光成像儀器。一些制造商提供熒光成像儀器，其中大多數(shù)使用激光或基于led的照明與濾波器的組合，以提供適當?shù)募ぐl(fā)光波長，然后捕獲適當?shù)陌l(fā)射光輸出。多數(shù)儀器使用專門的CCD相機來捕捉信號，得到的數(shù)據(jù)是數(shù)字化的結(jié)果。
具有不同激發(fā)和發(fā)射光譜特性的熒光染料的種類不斷增加。具有非重疊光譜的熒光團可以進行多重分析，從而在同一泳道和同一印跡膜上檢測到兩個或三個不同的目標蛋白，并進行獨立識別。然而，成像儀器必須配備一套適當?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射濾波器，以解決產(chǎn)生的熒光信號。一些儀器專門用于檢測紅外和近紅外熒光體，而另一些儀器則用于分析可見范圍內(nèi)的多種熒光染料。越來越多的現(xiàn)代儀器可以結(jié)合熒光成像在可見光和近紅外/紅外范圍。
量子點具有較寬的激發(fā)光譜，不同發(fā)光波長的可以用一個光源同時激發(fā)產(chǎn)生不同顏色熒光，這是傳統(tǒng)有機熒光材料所不具有的特點；具有較高的熒光發(fā)光效率，量子點檢測不必限定在近紅外區(qū)域就可以達到較高的檢測靈敏度，一般紫外光可以激發(fā)量子點產(chǎn)生較強的熒光。量子點優(yōu)異的光學性能，是的量子點熒光WB的檢測儀器大大簡化。一般生物實驗室常用的“紫外凝膠成像儀”就可以滿足檢測要求，大大降低了熒光WB技術的實際應用場景。
圖5 不同熒光成像儀量子點WB檢測結(jié)果的比較